News & Artikel Abschlussbericht [01.03.2011]
des Forschungsprojekts mit Förderung durch die ARGUS-Stiftung, Berlin
Titel des Projektes
„Funktionsanalyse der Proteinkinase pUL97 des humanen Cytomegalovirus – ein Zielmolekül für neue antivirale Therapieansätze“
Antragsteller
Prof. Dr. Manfred Marschall
Dienststellung: wissenschaftlicher Angestellter, Hochschullehrer
Institution/Dienstadresse:
Virologisches Institut
des Klinikums der Universität Erlangen-Nürnberg,
Klinische und Molekulare Virologie,
Schlossgarten 4, 91054 Erlangen
Tel. (09131) 85-26089
E-mail manfred.marschall@viro.med.uni-erlangen.de
Die virale Proteinkinase pUL97 ist eine multifunktionale Determinante der Effizienz der HCMVReplikation und phosphoryliert sowohl virale als auch zelluläre Substratproteine. Die vorliegenden Ergebnisse zeigen, dass pUL97 in Form von zwei Isoformen exprimiert wird (90 und 100 kDa). Der Leserahmen UL97 weist eine ungewöhnliche Kodierungsstrategie auf, indem fünf ATGStartcodons in demselben Leseraster innerhalb der N-terminalen 157 Aminosäuren angeordet sind. Ein Site-directed-Mutageneseansatz ermöglichte die transiente Expression von Punkt- sowie Deletionsmutanten und Proteomics-Analysen führten zu der Evidenz, dass die Ausbildung der großen und kleinen Isoformen eine alternative Initiation der Proteintranslation zugrunde liegt, mit den jeweiligen Startpunkten bei Aminosäuren 1 bzw. 74. In vitro-Kinaseassays demonstrierten, dass die katalytische Aktivität (in Form von Autophosphorylierung sowie Histon-Substratphosphorylierung) für beide Isoformen gleichermaßen nachweisbar ist. Eine Analyse der intrazellulären Verteilung des pUL97 durch konfokale Laserscanning-Mikroskopie demonstrierte, dass beide Isoformen eine ausgeprägte nukleäre Lokalisation aufweisen. Überraschenderweise zeigten Mapping-Experimente zum Ziel der Identifizierung der zugrundeliegenden nukleären Lokalisationssignale (NLS) von pUL97, dass der Mechanismus der nukleären Translokation für die zwei Isoformen unterschiedlich ist. Während der extreme N-Terminus (große Isoform) ein hocheffizientes „bipartite“ NLS trägt (amino acids 6–35), wurde für den weiter innen im Protein liegenden Abschnitt (hinter Aminosäure 74 gelegen; kleine und große Isoformen) eine zweite, weniger effiziente NLS-Sequenz identifiziert. Zusammenfassend lässt sich aussagen, dass für die nukleäre Translokation der Kinase pUL97 ein komplexer Mechanismus existiert, welcher auf regulatorische Unterscheide zwischen den Isoformen hinweist und welcher möglicherweise für die Entwicklung therapeutisch einsetzbarer Inhibitoren genutzt werden kann.
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